Молекул генетикийн судалгааны арга

судлах, ДНХ-ийн бүтэц ашигласан молекул генетикийн аргаар хувилбаруудыг тодорхойлох. ДНХ-ийн бүс нутаг, хромосомын, генийн буюу аллель нь энэ бүс нутгийг судлах бүрийн хувьд, арга ялгаатай. тус бүр молекул генетикийн аргыг суурь эсвэл зарим РНХ болон ДНХ-ийн бусад удирдахыг бүрдэнэ. ямар ч лабораторийн нөхцөлд хийж чадахгүй байгаа эдгээр бүх аргууд нь их төвөгтэй тодорхойлогддог бөгөөд ажилтнууд өндөр мэргэшсэн байх ёстой. Энэ ажил нь хэд хэдэн үе шаттайгаар явуулсан байна.

үе шатууд

Нэгдүгээрт, РНХ болон ДНХ-ийн дээж үйлдвэрлэсэн байх ёстой. Энд нэг молекул генетикийн арга бараг ямар ч материал хэрэглэж болно: соёл фибробласт цус, лейкоцит нь дусал, салст (хусч), тэр ч байтугай үсний уутанцар, - ДНХ-ийн ямар ч төрлийн дээжийг авч болно. Энэ нь ямар нэгэн молекул генетикийн аргууд болон тэдгээрийн янз бүрийн боломжуудыг ашиглах нь тохиромжтой байдаг, урт ялгасан ДНХ-ийн хөлдөөсөн хадгалагдаж байдаг байна. энэ нь (амьд организмын оролцоогүйгээр vitro-д) полимеразын гинжин vitro-д урвал байдлыг хангах нь тусалдаг гэж хоёр дахь үе шат, ДНХ-ийн хүссэн хэлтэрхий (олшруулалт) хуримтлал зориулсан байна. Үүний үр дүнд энэ гинжин урвалын сонгосон ДНХ-ийн хэсэг үржүүлж, болон ДНХ-ийн өсөлт дахин утгаараа сая дүн.

молекул генетикийн судалгааны аргын гурав дахь алхам нь үржүүлэгчээр үржүүлсэн ДНХ-ийн хязгаарлалтыг (энэ хуваагдал, урагдалт, эсвэл зүсэх) гэж үзнэ. Хязгаарлах нь polyacrylamide, эсвэл үүнийгээ агарос гель дээр электрофорез гүйцэтгэсэн. ДНХ-ийн фрагментийг суралцаж Энэ молекул-генетикийн арга нь хүн бүр гель нь тодорхой байр суурийг авах боломжийг олгодог. Үүний дараа гель ethidium бромид эмчилсэн байна, ДНХ-ийн нь заавал чадвартай, хэт ягаан туяаны гэрлээр Цацрагийн, дараа нь энэ нь боломжтой ялгаруулах хэсгийг ажиглаж байна. Молекул генетикийн оношлогооны аргууд нь харилцан адилгүй, олон байдаг, гэхдээ эхний хоёр алхам бүх элбэг байдаг. Харин ДНХ-ийн хэсэг дээр тодорхойлохын тулд, гель өнгөтэй болох бөгөөд бусад олон байгаа арга.

зүйл

илрүүлэх микобактерийн хамгийн шууд, өргөн тархсан арга нь дээрх молекул генетикийн ДНХ-ийн сургалтын аргыг оруулж болно. Түүний мөн чанар нь тухайн эмгэг төрүүлэгчдийн ДНХ-ийн тодорхой хэлтэрхий нь скан гинжин материалыг тодорхойлохын тулд. Молекул генетикийн оношлогооны арга хараахан сүрьеэ зэрэг өвчнийг хүлээн зөвшөөрөх нь илүү үр дүнтэй арга байхгүй байна. полимеразын гинжин урвал (ПГУ) үүсгэж ашиглах нь, та эх ДНХ-ийн хувь тоог нэг сая үед, өөрөөр хэлбэл, нэмэгдүүлэх болно гэж олшруулалт байх болно, мөн энэ нь үр дүнг харуулах болно гэдэгт итгэлтэй байж болно. ерэн таван хувь нь энэ аргын гол давуу тал нь илүү - Мэдрэмтгий байдлын түвшин маш өндөр байна.

гарц олон хувь нь үр дүнтэй судалгаа молекул-генетикийн арга үлдсэн хэсэг нь шууд утгаараа энэ тохиолдолд төсөл боловсруулах дээж тодорхой олигонуклеотид дараалал нэг зуун зургаан дахин өссөн байна оноос хойш хоёр дахин нэмэгджээ. Амьсгалын тогтолцооны сүрьеэ ч гэсэн соёл онош түүний мэдрэмжийг нэлээд бага байна. Энэ нь орчин үеийн анагаах ухааны сүрьеэгийн оношлогооны молекул генетикийн арга дээр суурилсан учраас юм. А тайлбарласан арга бүр илүү хэцүү байдаг өндөр эсрэгтөрөгчийн өөрчлөлтийн эмгэг үүсгэгч ажиллаж ялангуяа бусад арга замыг тодорхойлох нь үр дүнтэй байдаг - Тусгай шаардлагатай шим тэжээлийн хэвлэл мэдээллийн хэрэгсэл , урт цаг хугацаа хөгжүүлснээр. Биохимийн болон молекул генетикийн аргууд үр дүнд маш их ялгаатай нөлөө бий.

сүрьеэгийн онош

сүрьеэ Маршал ПГУ-ын онош хамгийн түгээмэл өвчин бүх дөрвөн төрлийн тодорхой хүмүүст ДНХ-ийн дарааллыг ашиглаж байна. Энэ зорилгодоо хүрэхийн тулд ихэвчлэн эдгээр элементүүд нь маш их нүүдлийн зүйлүүдийг Mycobacterium сүрьеэ, үргэлж геном дахь одоогийн олон хуулбарыг тодорхойлох зэрэг дараалал элемент (IS-986, IS-6110) IS илрүүлэх праимерууд ашигладаг. Мөн ДНХ-ийн олборлолт бусад тохиромжтой аргаар цэвэр соёл, Клиникийн (өвчтөний цэр) -ээс хийж болно. guanidine thiocyanate болон Цахиурын зөөгч ДНХ зэрэг дээр үндэслэн Жишээ нь, тэнд Boom арга лизис буфер ашиглаж байгаа бол. жил бүр өсөн нэмэгдэж ядуу бактериологийн ялгаатай тул эмнэлзүйн практикт байгууллагын огт өөр түвшинд бий болгосон өвчтөнүүдийн тоо: ДНХ судлах молекул-генетикийн арга оношлогоонд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг байна.

Гэсэн хэдий ч, бид сул талуудтай ч биш гэдгийг хүлээн зөвшөөрөх ёстой. ПГУ-ын арга нь ихэвчлэн хэрэглэх нь хуурамч-эерэг үр дүн нь асар олон тооны авчирдаг бөгөөд шалтгаан нь зөвхөн техникийн алдаа, гэхдээ бас аргын өөрийнх нь онцлог юм. Үүнээс гадна, микобактерийн, тодорхойлсон байна оршин тогтноход тодорхойлох оношлогооны энэ аргыг ашиглан, энэ нь ердөө л боломжгүй юм. Гэхдээ энэ сул тал нь хамгийн чухал биш юм. ПГУ-ын оношилгоо, молекул генетикийн аргууд нь микобактерийн ДНХ-ийн бохирдлын эрсдлийг шаарддаг. Энэ шалтгааны улмаас Гэрчилгээний шаардлага ПГУ-ын лабораторид нь зөвхөн хатуу зорилготой гэж тэд гурван тусдаа байр шаарддаг. ПГУ-ын технологийн зохих тоног төхөөрөмж, өндөр мэргэжилтэй боловсон хүчнийг хэрэглэхийг шаарддаг, орчин үеийн, маш төвөгтэй юм.

bacterioscopy

шинжилгээний онош үр дүн нь бусад мэдээ харьцуулахад байх ёстой Хэзээ: эмнэл зүйн үзлэг, рентген, т рхэцийн бичил харуур, газар тариалан, тэр ч байтугай тодорхой эмчилгээ хариуд нь маш чухал ач холбогдолтой байдаг. Энэ цуврал нь ПГУ-ын судалгаагаар зөвхөн хэсгүүдийн нэг юм. эрт оношлох эмгэг илрүүлэх энгийн бөгөөд хурдан арга байж болно - бактериологийн.

гэрэл микроскоп (Циль-Нильсений будах) болон гэрэл гэгээтэй (будах fluorochromes) байдаг ашиглаж байна. давуу тал нь үр дүнд т рхэцийн хурд юм. Гэвч түүний сул тал нь зөв улмаас бага мэдрэмж нь хүчин чадал хязгаарлагдмал гэж үзэж байна. Гэсэн хэдий ч энэ арга нь хамгийн их, эдийн засаг, сүрьеэ өвчтөнд илрүүлэх үндэслэл ДЭМБ-ын зөвлөмжийг өгсөн байна. микобактер нян судлалын аргаар илрүүлэх урьдчилан үнэ цэнэ, тооцсон тоон бактерийн ялгаралтыг байна. Их итгэлтэй сүрьеэ энэ нь молекул генетикийн судалгааны аргаар шийдвэрлэх.

соёл

микобактерийн илүү сайн илрүүлэх соёлын судалгааг хүлээн зөвшөөрч байна. эмгэг материалыг Тариалах энэ нь өндөг дунд болгож байна: Mordovsky, Finn II, LJ, гэх мэт. vitro-д эм, микобактерийн хэд хэдэн үр нөлөө шууд бус нотлох баримт, тэдний колони нь микобактерийн эсэргүүцэл харьцуулалт, судалгааны соёл, хэрэглэсэн арга бол. эмгэг материалын микобактер тарих нь тусад хувийг олон орчны дээр эзэмшиж байгаа нэмэгдүүлэх.

олон тооны соёл, эмгэг зэрэг буцалтгүй тусламж болон шингэний хэрэгцээг хангах. Энэ системд ашиглаж, автомат хэмжих төрөл VANTES өсөлт. Газар тариалан, долоо найман долоо хоног хүртэл өсгөвөрлөсний хотноо байх ёстой. Энэ үед өсөлтийн дутмаг газар тариалан сөрөг гэж үзэж болно. Оношлогооны материал Халдварыг Гвиней гахай, сүрьеэ маш мэдрэмтгий байдаг: Mycobacterium сүрьеэ илрүүлэх хамгийн үр дүнтэй арга нь биологийн дээж авч үзье.

Зарим тоо

далд халдвар - Судалгааны сонирхолтой талбай, ПГУ-ын оношилгоо нээж байсан М. сүрьеэ судлах явдал байв. Сүрьеэгийн халдвар авсан орчин үеийн үзэл баримтлал нь M. сүрьеэ харьцаж байсан зуун хүн гарч, ерэн болох сайн халдвар авсан гэсэн байх боловч тэдний зөвхөн арван өвчний идэвхтэй хөгжиж байгаа юм байна. Бусад TB дархлаа байгаа бөгөөд хэргийн ерэн хувь нь, учир нь халдвар нууц хэвээр байна. загварыг илрүүлэх энэ нь молекул генетикийн аргаар тусалсан байна.

Генетикч гарал нь үр тариа эмгэг материал сөрөг байсан ба M. сүрьеэ нь халдвартай хүмүүсийн наян хувь нь, харин өвчин ямар ч рентген илрэл нь урсаж хүмүүсийн тавин таван хувь, ПГУ-ын эерэг хариулт авсан гэж ярьдаг. Энэ нь сөрөг генетикийн оношлогооны арга нь тэдний шинжилгээ (микроскоп, соёл) үр дүнг нь ПГУ-ын судалгаагаар эрсдэлтэй өвчтөнд тодорхойлоход тусалж байсан бөгөөд subclinical халдвар M. сүрьеэ бэлэг байсан юм.

орчин үеийн судалгаа

Griess урвалж туршиж микобактерийн нь нитратын үйл ажиллагаа: ОХУ, нян судлалын лабораториуд нь үнэмлэхүй агууламж нь хурдасгасан арга хэрэглэж байна. Anti-сүрьеэгийн төв эмийн дасал тодорхойлох боломжийг олгодог аргыг ашигладаг. автомат микобактерийн нь радиометрийн болон гэрэл гэгээтэй нягтлан бодох бүртгэлийн систем өсөлт шингэн хэвлэл мэдээллийн хэрэгслээр энэ тарин. хоёр долоо хоног хүртэл - Ийм дүн шинжилгээ хурдан хийж байна.

Одоогийн байдлаар, шинэ арга боловсруулсан байна: микобактерийн эмийн дасал генотип түвшинд хэмжинэ. эсэргүүцэл генүүдийн молекул механизмыг болон судалгаа микобактерийн-д байгааг харуулж байна. Эдгээр генүүд зарим эмийн дасалтай холбоотой байдаг. Жишээ нь, kasA ген, inhA нь, katG изониазид, rpoB генийн тэсвэртэй - рифампицин 16Sp РНХ ген болон rpsL - стрептомицин, emb1 - этамбутол, gyrA нь - тийм дээр fluoroquinolone болон.

мутаци

Орчин үеийн онош ихээхэн ДНХ судлах молекул-генетикийн түвшинд аргыг нэмэгдэж, тэдний бүх спектр нь мутаци томоохон хэмжээний судалгаа хийх боломжийг олгосон юм. Одоо бид 516, 526 болон 531 кодоны хамгийн түгээмэл мутаци rpoB генийн, янз бүрийн мансууруулах бодис эсэргүүцэл тодорхойлсон гэдгийг би мэднэ. нь зөвхөн уламжлалт аргыг ашиглан микобактерийн нь бичдэг байхын тулд арга нь бүхэл бүтэн хүрээ байдаг - биохимийн биологийн болон соёлын төдийгүй өргөн орчин үеийн молекул генетикийн арга техникийг ашигладаг. Аль хэдийн хангалттай байдаг ба генийн өвчин илрүүлэх зөв оношлох аргыг олгодог. Тэд тухайн генийн яг нутагт ДНХ-ийн судалгааны дээр үндэслэсэн байдаг. Энэ нь ихэвчлэн цогц үйл явц юм цаг хугацаа шаардсан, өндөр үнэтэй, харин молекул генетикийн шинжилгээнд өгсөн бөгөөд өгөгдөл, бусад бүх шинжилгээний өгөгдлийг илүү үнэн зөв, мэдээлэлтэй юм.

Энэ нь урт удаан ДНХ-ийн ямар ч nucleated эс odnakova байгааг организмын бүх амьдралын өөрчилж болохгүй вэ гэж мэдэгдэж байсан бөгөөд энэ нь боломжит ontogeny аль ч шатанд, биеийн үнэхээр бүх эсийн шинжилгээ авч байна. гэмтсэн генийн бүрэн хэмжээний эмнэлзүйн өвчний анхны шинж тэмдэг илэрч, түүнчлэн эрүүл heterozygous ард түмний өмнө илрүүлсэн боловч генийн мутацийн байх болно. Молекул генетикийн удамшлын өвчин оношлох арга нь (шууд арга, ДНХ-оношлогоо) илчлэх, түүнчлэн Хилийн талбарын ДНХ (генийн полиморфизм), нягт нь гэмтсэн генийн (өөрөөр хэлбэл, ДНХ-оношлох шууд бус арга) нь холбоотой байгаа нь гэр бүлд өвчний тусгаарлах дүн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог. Шууд буюу шууд бус байдлаар - ямар ч ДНХ-ийн оношлогооны хүний ДНХ-ийн нь хатуу тогтоосон хэсгийг тодорхойлох арга дээр үндэслэсэн.

шууд арга

буруутан генийн удамшлын өвчин гэх мэт сайн мэдэх, мэдэх үед ДНХ-ийн оношлох шууд аргууд, түүний мутаци төрөл. Жишээ нь, өвчний тоо тохиромжтой шууд арга. Энэ Huntington-ын chorea (өргөтгөл CTG-давталтын), phenylketonuria (R408W), цист фиброз (delF508, гол мутаци) гэх мэт. Шууд аргын гол давуу тал нь бүрэн эзэмшлийн оношлогооны үнэн зөв бөгөөд гэр бүлийн бусад нь ДНХ-ийн шинжилгээ хийх ямар ч шаардлага байхгүй. Хэрэв харгалзах генийн мутацийн байдаг, энэ нь яг дарамт гэр бүлийн бусад нь удамшлын, генотип тодорхойлох оношийг батлах боломжийг олгодог.

шууд оношлох өөр нэг давуу тал нь өвчнөөр нас барсан хамаатан садан, эцэг, эхээс нь муу мутаци нь heterozygous тээвэрлэгч тодорхойлох гэж үзэж байна. өвчин рецессив аутосомын энэ нь ялангуяа үнэн байдаг. Шууд аргын сул тал бас байдаг. тэдгээрийг хэрэглэхийн тулд, та яг мэдэж түүний спектр, түүний мутаци хэвийн бус генийн, exon-интронгүй бүтцийг нутагшуулах хэрэгтэй. бүх генийн өвчин өнөөдөр бус, ийм мэдээлэл авсан байна. Учир нь нэг ижил генийн удамшлын өвчин хөгжлийг шалтгаан эмгэг мутаци нь олон тооны байж болох Informativeness шууд арга, бүрэн гүйцэд авч болохгүй.

шууд бус арга

ДНХ-ийн оношлох шууд бус аргуудыг бүгдийг нь, бусад тохиолдолд гэмтсэн генийн тодорхойлж байгаа бол зөвхөн chromosomally ашиглаж байгаа хэдий ч, эсвэл шугам онош үр дүн (энэ нь яах генийн цогц молекул байгууллага, том хэмжээ нь их байдаг бол уу өгөөгүй байсан бол эмгэг мутаци). Шууд бус арга зүйлийн аллел гэр бүлд полиморф маркерийн тусгаарлагдсан дүн шинжилгээ хийсэн. нэг хромосомын бүс нутаг, Locus олж маркерууд нягт өвчин холбоотой бөгөөд хасах буюу insertions, цэг сэлгээг, давтан төлөөлж, тэдний полиморфизм блок дахь эсүүд өөр өөр хэмжээтэй холбоотой юм.

шууд бус оношлогоо гэж үздэг микросателлайт болон minisatellite полиморфизм, хүний геномын өргөн тархсан байдаг нь хамгийн тохиромжтой. тэдгээрийн үнэ цэнэ, өндөр мэдээллийн агуулгыг илэрхийлсэн Хилийн ба генийн хооронд генетикийн зайд хохирол хэтэрхий том биш бол. Сүүлийн тохиолдолд, тооцоо үнэн зөв полиморф Хилийн болон хохирлын хооронд рекомбинаци давтамж нь их хэмжээгээр тодорхойлно. Шууд бус оношлогооны аргууд нь мөн өвчтөн болон мутаци тээгч дунд шинжилсэн хүн амын судалгааны аллелийн давтамжид заавал урьдчилсан алхам нэмж nonequilibrium болон наалдамхай маркер болон мутант аллелийг лавлаж рекомбинаци магадлалыг тодорхойлох шаардлагатай болдог.

бусад аргууд

РНХ болон ДНХ-ийн Богино сегмент, түүнчлэн бичил судалгааны хүрээнд харагддаг нэг генийн Тиймээс молекул генетикийн оношлох шаардлагатай мутацийг тодорхойлох, байж болохгүй. маш их удамшлын өвчин оношлох боломжийг өргөжүүлэх нь "Хүний геномын төсөл", түүнчлэн молекул генетикийн бусад урьдчилгаа байдаг - өмнөх болон төрсний дараах үеийн аль аль нь. Эдгээр аргууд нь эрт илрүүлэлт хангах, нэг таамаглал Политехникийн ба генийн өвчин, түүний дебют насанд явагддаг хийж болно. Харамсалтай нь, молекул генетикийн судалгааны арга техник, чадавхид улмаас онош өсвөр болон бага байна, ялангуяа үед, заримдаа өв холбогдуулан тогтоосон ёс зүйн хязгаарын гадна байдаг.

Бүтцийн ба тоон хромосомын эмгэг өвчин, хорт хавдар, олон согог хамгийн түгээмэл шалтгаан болж байна. Ирээдүйн жирэмслэлт нь нөхөн үржихүйн эрсдэл хамт таамаглал үнэлэх - хромосомын aberrations гэр бүлийн зөвлөгөө өгөх нь чухал юм, тодорхойлох хэрэгтэй. Хромосом шинжилгээ генетикийн оношлох нь "алтан стандарт" юм, гэхдээ энэ нь хязгаарлагдмал байдаг. Зөвхөн арга молекул генетикийн шинжилгээнд сонгодог илрүүлэх боломжгүй байгаа нарийн хромосомын өөрчлөлтийг тодорхойлох нь тэдний өндөр мэдрэг чадвартай технологи дээр суурилсан гэрэл гэгээтэй хаяг клон тэнд ашиглаж, учир нь илүү хийж чадах cytogenetic судалгаа. Эдгээр арга нь улам нь манай оношлогооны чадавхийг өргөжүүлэх байна, шалгаж байх үед, хөгжлийн бэрхшээлтэй, сэтгэцийн хомсдолтой, бусад олон удамшлын өвчин нь хүүхдүүд.

үр дүн нь

Энэ нь генийн бүтэц, мэдлэг, үйл ажиллагаа, өөрчлөлтийн төрөл, молекул генетикийн хөгжилтэй уялдан гарсан удамшлын өвчнийг илрүүлэх чадвар байсан хүн төрөлхтний хувьд маш чухал юм. түүний арга ДНХ-ийн молекулын судалгааны чиглэсэн байна - хэвийн юм, мөн энэ нь гэмтсэн үед. нуклеотидийн (ДНХ) -ийн deoxyribonucleic хүчлийн дарааллыг бэлтгэх бие даасан хэсэг дээр тодорхойлох дээжийг хүлээн үе шаттай үргэлжилнэ. хэлтэрхийнүүдийн эсээс геномын ДНХ-, хязгаарлалт (урагдалт), олшруулах (клон), электрофорез нь Тусгаарлах (үүнийгээ агарос гель өөрсдийн цахилгаан цэнэг болон молекул жин нь тусад нь). нь салангид судлын гадаргуу дээр байрлах тодорхой хэлтэрхий тодорхойлох.

Дараа нь үйлдэл тусгай шүүлтүүр, дамжуулан cloned ДНХ-ийн хэлтэрхий буюу синтетик цацраг идэвхт сорьцтой тус бүр хэсэг гибридезац өнгөрөх руу авч хяналтын шинжилгээний дээж тус бүрт тэнцүү байх болно юм. Та нар шалгаж харьцуулахад байр суурь, эсвэл уртыг өөрчлөх бол, хэрэв шинэ хэсэг, эсвэл алга болсон - энэ бүх шинжилгээ генийн нуклеотидын дараалал дахь бүтцийн өөрчлөлт хийгдсэн байна гэдгийг харуулж байна. молекул генетикийн судалгаа найман үндсэн арга байдаг: дараалал (ДНХ-ийн дараалал тодорхойлох), полимеразын гинжин урвал (дарааллын тоо нэмэгдсэн), праймер алдартай генийн бэлтгэх, ДНХ-ийн клон, рекомбинант молекул улмаас рекомбинант молекулуудын үйлдвэрлэлийн гаралтай уураг, иж бүрэн бий болгох (цуглуулах номын сан) хязгаарлалтыг ашиглан олж авсан байсан хэсэг дээр cloned.